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Structural Biology

La microscopía crioelectrónica desvela cómo crecen los cristales de proteínas

Este descubrimiento permite a los investigadores controlar la cristalización y podría emplearse para ayudar en la formulación de medicamentos.

by Carmen Drahl
April 4, 2018 | APPEARED IN VOLUME 96, ISSUE 15

 

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Credit: Adaptado de Nature
Cristales con forma prismática nacen a partir de un gel de glucosa isomerasa (izquierda)

Cristalizar una proteína puede ser un tiro a ciegas. Nadie sabe exactamente cómo se forman los cristales de proteínas, así que los investigadores deben emplear frecuentemente el método de ensayo y error para encontrar las condiciones de cristalización correctas. Ahora, los científicos han usado la microscopía crioelectrónica, una técnica que se llevó Nobel de química en 2017, para observar las primeras etapas de formación de cristales de proteínas (Nature 2018, DOI: DOI: 10.1038/nature25971). Lo que aprendieron en el proceso les permitió generar una forma deseada de cristal, o polimorfismo, de manera selectiva, lo que podría ser útil en la determinación de la estructura de proteínas o en la formulación de fármacos proteicos.

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Credit: Adaptado de Nature
Un microscopio óptico revela la forma rómbica (izquierda) y prismática de un cristal de glucosa isomerasa.

La cristalización comienza con pequeñas agrupaciones de moléculas de proteínas que actúan como semillas, dice Mike Sleutel de Vrije Universiteit Brussels, quien dirigió el trabajo. Estas agrupaciones son demasiado pequeñas para ser vistas con un microscopio óptico, y son inestables. Para superar ambos retos, Sleutel, Alexander E. S. Van Driessche de la Grenoble Alps University y sus compañeros optaron por congelar rápidamente sus muestras de proteínas para detener el movimiento molecular, y así tener fotografías en varios momentos del proceso de cristalización con microscopía crioelectrónica. Otras técnicas ya habían provisto de una visualización parcial del proceso de cristalización, pero nadie había usado la microscopía electrónica en este tipo de muestras antes. “Teníamos dudas de que fuéramos a ver algo”, dice Sleutel.

Los investigadores observaron la proteína glucosa isomerasa, que Sleutel había estado estudiando durante una década, tras añadirle reactivos que dieron lugar a la cristalización. Los investigadores conocen la estructura de esta proteína, y saben que puede cristalizar dando lugar a una forma rómbica similar al diamante o a una forma rectangular prismática. A través de sus estudios de microscopía crioelectrónica, el equipo de Sleutel averiguó que el camino que lleva a cada uno de estos polimorfismos es diferente. El camino hacia la forma rómbica sigue la teoría clásica de formación de cristales; las semillas más pequeñas que se detectaron eran versiones en miniatura de los cristales de mayor tamaño. Por el contrario, los prismas se formaron a través de un camino de varios pasos que los investigadores no habían considerado anteriormente. Primero, las moléculas de proteínas se organizan en varas nanométricas lineales. Estas ‘nanovaras’ se agrupan en fibras y acaban dando lugar a cristales prismáticos. “Ver ‘nanovaras’ nos dejó con la boca abierta”, dice Sleutel, “estas partículas eran completamente inesperadas.”

Otra sorpresa fue que el equipo detectó fibras de nanovaras en muestras que habían fracasado al cristalizar. Estas muestras formaron un gel, que es un camino sin salida para un cristalógrafo, igual que una masa marrón al fondo de una probeta es un fracaso para un químico orgánico. Sin embargo, cuando los investigadores transfirieron una pieza del gel a una disolución que anteriormente había dado lugar a cristales rómbicos empezaron a crecer cristales de forma prismática. El hecho de que el equipo obtuviera cristales prismáticos en vez de rómbicos sugiere que el gel también puede ser usado como semilla para un polimorfismo determinado.

El equipo encontró otra manera de generar un polimorfismo de forma selectiva. Al examinar las imágenes de microscopía crioelectrónica y la estructura de la proteína, determinaron que los aminoácidos en la superficie de la proteína realizan contactos intermoleculares en cada una de las dos formas cristalinas. Al mutar estos aminoácidos, pudieron desestabilizar una de las formas y promover la formación de la otra. El estudio se limita solo a una proteína pero el equipo espera poder aplicar estas técnica a otras, según Sleutel.

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Peter G. Vekilov, que estudia la formación de cristales de proteínas en la Universidad de Houston, califica esta investigación como “sobresaliente”. El trabajo de otras personas, incluyendo el suyo propio, apunta a que la formación de cristales de proteína parte de un estado amorfo parecido al líquido. Velikov piensa que el estado desordenado podría estar presente en estos caminos de cristalización, e indica que esto no disminuye el impacto de los resultados de este equipo, especialmente el descubrimiento sorprendente del camino que lleva a las nanovaras. Si el estado amorfo estuviera presente, puntualiza Lloyd, la microscopía crioelectrónica debería ser capaz de detectarlo, pero tras horas de observación durante horas, ni él ni sus compañeros pudieron verlo.

Según Karen Allen, cristalógrafa de la Boston University, conseguir la forma adecuada de un cristal resulta vital para algunos estudios. Por ejemplo, en ocasiones los investigadores quieren que la estructura de una proteína se una a una molécula y una de las formas cristalinas bloquea el acceso al sitio en el cual tiene que situarse la molécula. Los científicos ya modifican las superficies de las proteínas para mejorar la cristalización, pero favorecer la creación de cristales de una forma específica ha resultado siempre muy difícil de conseguir, añade. Sin embargo, destaca que la estrategia de mutación seguida por el equipo para controlar el polimorfismo fue posible debido a que ya conocían la estructura tridimensional de la glucosa isomerasa. Sleutel admite que el método mediante gel es más universal debido a que no requiere un conocimiento previo de la estructura de la proteína.

Estos hallazgos podrían ser “altamente valiosos” para los fabricantes de medicinas que buscan una forma específica de polimorfismo, según indica Naír Rodríguez-Hornedo de la University of Michigan College of Pharmacy. Los diferentes polimorfismos podrían tener solubilidades diferentes, un factor importante en la formulación, tal y como ella explica, y los descubrimientos facilitados por este trabajo podrían evitar desechar grandes cantidades de material valioso en el proceso de ensayo y error de una miríada de condiciones de cristalización.


Traducción al español producida por Juan José Sáenz de la Torre de Divulgame.org para C&EN. La versión original (en inglés) del artículo está disponible aquí.

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