Algunos editores CRISPR de bases nitrogenadas causan mutaciones inesperadas

Los artículos publicados por dos grupos independientes sugieren que un tipo de edición genética CRISPR, conocida como edición de bases, causa un alto número de mutaciones impredecibles en arroz y embriones de ratones.

No es la primera señal de alerta en torno a CRISPR. Otros grupos han expresado su preocupación sobre las mutaciones generadas por el método tradicional CRISPR-Cas9 cuando corta el ADN en una zona que, supuestamente, no tenía que tocar. Sin embargo, los resultados de estos nuevos trabajos son sorprendentes porque los científicos habían alabado los editores de bases nitrogenadas como una de las formas más precisas de edición genética.

Los editores de bases nitrogenadas están diseñados para cambiar un nucleótido (una letra) del ADN por otra sin cortar el ADN. Y existen dos versiones: los editores de citidina, que convierten un nucleótido de citosina (C) a timina (T), y los editores de adenina, que convierten adenosina (A) en guanosina (G). Las dos variantes fueron creadas en el laboratorio de David Liu en el Broad Institute del MIT y Harvard.

Decenas de laboratorios han publicado artículos usando los editores de bases en plantas y animales, y Liu ha cofundado dos empresas ‘start-up’ para comercializar su tecnología: Pariwise Plants y Beam Therapeutics.

Descubrir las mutaciones causadas por CRISPR fuera de su objetivo es muy difícil, porque las células de organismos diferentes (o incluso células diferentes de un mismo organismo) pueden tener un ADN ligeramente distinto debido a mutaciones espontáneas que ocurren con el tiempo. Salvo que los ADN de una célula editada y no-editada sean completamente idénticos, es muy complicado averiguar si las discrepancias fueron causadas por CRISPR o son fruto de mutaciones naturales.

Hui Yang y un equipo de investigadores del Instituto de Ciencias Biológicas de Shanghai han hallado una forma muy inteligente de diferenciar los dos tipos de mutaciones. Usando embriones de ratón con sólo dos células -que deberían tener un ADN idéntico- inyectaron editores tanto CRISPR-Cas9 como editores de citidina en una de las células, dejando la otra sin editar. Después de dejar crecer los embriones durante dos semanas, secuenciaron el ADN para comparar las células editadas y no-editadas. Las células en las que se habían editado las bases nitrogenadas tenían 20 veces más mutaciones de una ‘letra’ de ADN que las células editadas con CRISPR-Cas9 y las células sin editar. Los resultados “nos sorprendieron a todos,” dice Yang.

Yang reclutó a Lars Steinmetz, un genetista de la Universidad de Stanford, para que le ayudara a analizar los resultados. “Yo suponía que los editors de bases nitrogenadas iban a ser más seguros que el corta y pega de CRISPR-Cas9,” dice. Pero todavía quedaban más sorpresas. El equipo de Yang repitió el experimento con editores de adenina, y descubrieron que no tenían los mismos problemas (Science 2019, DOI: 10.1126/science.aav9973).

“Creo que estos resultados han preocupado a la comunidad que trabaja en editores de citosina,” dice Yang. “Necesitamos editores de bases muchísimo más específicos para conseguir resolver este problema.” Su laboratorio ya está trabajando en editores de bases nitrogenadas que causen menos mutaciones fuera de su objetivo.

Otro estudio independiente, liderado por la genetista de plantas Caixia Gao del Instituto de Genética y Biología del Desarrollo en Pekín, encontró resultados similares probando los editores de adenina y citidina en arroz. Su equipo descubrió también que los editores de citidina daban lugar todavía a más mutaciones cuando faltaba una de las piezas del editor: el ARN guía (Science 2019, DOI: 10.1126/science.aaw7166).

Los editores CRISPR-Cas9 y los editores de bases nitrogenadas son guiados a su destino por una hebra de ARN. Un guía mal elegido puede causar mutaciones en zonas del ADN con secuencias que son parecidas, pero no exactamente complementarias a la secuencia del guía. Hasta el momento, los científicos habían pulido los diferentes métodos de edición CRISPR optimizando el diseño de la guía de ARN.

Steinmetz cree tener una explicación a por qué los editores de citidina crean mutaciones incluso cuando no se añade el ARN guía. Los editores de citidina contienen una enzima llamada citidina desaminasa, que convierte el nucleótido de citosina en un uracilo (U). Posteriormente, durante la replicación o reparación del ADN, la célula reemplaza este uracilo -que no se encuentra de forma natural en el ADN- por timina, lo que completa el cambio deseado. Pero la citidina desaminasa podría estar actuando sobre el ADN por su cuenta, sin hacer caso a las instrucciones del editor de bases, sugiere Steinmetz. Esto no supone un problema para el editor de adenina porque usa una enzima diferente.

“La edición de bases está en su infancia y, siendo una técnica tan nueva, vamos a seguir encontrando cosas como estas,” dice Alexis Komor, que diseñó el editor de citidina original cuando era investigador postdoctoral en el laboratorio de Liu. Ahora dirige su propio laboratorio en la Universidad de California, San Diego, y cree que el problema podría resolverse modificando la enzima citidina desaminasa para que sea no pueda unirse por su cuenta al ADN.

Otro problema potencial es el inhibidor de la uracil-ADN-glicosidasa (UGI). Konor añadió este inhibidor a su editor de citidina para evitar que las células revirtieran el cambio volviendo a editar el uracilo para convertirlo en citosina. La aparición de uracilo es una mutación espontánea bastante frecuente, por lo que las células tienen mecanismos para arreglar estos problemas rápidamente. Komor piensa que es posible que la UGI en su editor de citidina esté bloqueando algunos de los mecanismos de reparación naturales de la célula.

Estos artículos están empezando a empujar a los expertos en CRISPR a diseñar mejores editores de bases nitrogenadas. “La elevada cantidad de mutaciones asociada a los editores de citidina es sorprendente y alarmante,” dice Yinong Yang, un patólogo de plantas en la Universidad de Pennsylvania State que ha usado CRISPR para diseñar champiñones que no se oscurecen. Yang dice que estos nuevos estudios sugieren que la especificidad de los editores de citidina “tiene que mejorarse significativamente.”

Muchos grupos ya han publicado artículos donde se describen nuevas versiones de los editores de bases nitrogenadas, incluido Lukas Dow, un biólogo especializado en cáncer de la Facultad de Medicina de Weill Cornell. El laboratorio de Dow ha mejorado la eficacia del editor en su zona objetivo, pero todavía queda mucho trabajo por hacer para reducir las mutaciones fuera de esta zona, dice. Aplaude la finura de los experimentos, pero añade que “todavía hay muchas incógnitas sobre cómo interpretar las implicaciones de estos artículos.”

Por ejemplo, no está claro si los resultados de las ediciones genéticas en embriones de ratón serían similares si usáramos células adultas. Liu indica que las dosis usadas en los experimentos son mucho más altas que las que se usarían en futuras terapias en humanos. También sugiere que la tasa de mutaciones de los editores de citidina no es tan alta como parece – es casi la misma que la tasa de mutaciones que aparecen de manera natural en células humanas. Tendría que valorarse el riesgo de introducir estas mutaciones y compararlo con la gravedad de la enfermedad que estamos tratando, añade.

Beam Therapeutics, una empresa que consiguió 87 millones de dólares el año pasado para crear editores de bases nitrogenadas para tratar enfermedades humanas, cree que los problemas que se presentan en estos artículos tienen solución. “Confiamos en que nuestros productos serán medicamentos, y vamos a seguir trabajando para empezar los ensayos clínicos,” dice John Evans, CEO de Beam. “Dicho esto, queda mucho trabajo por hacer.”

Evans explica que Beam tiene 10 programas de descubrimiento de nuevos fármacos en marcha, usando tanto editores de citidina como de adenina para tratar enfermedades genéticas. “No creemos que este descubrimiento vaya a bloquear el avance de los editores de bases genéticos, vamos a seguir trabajando para intentar probar nuestros medicamentos en pacientes,” añade Evans.

El miedo es algo muy común en campo de la edición genética CRISPR. Ya hubo estudios preclínicos que sugerían que CRISPR podía causar reacciones inmunológicas o cáncer. Muchos de estos miedos se disiparon pronto, pero otros permanecerán hasta que los estudios clínicos descubran nuevos datos. Gaétan Burgio, científico en la Universidad Nacional de Australia que ha seguido los desarrollos de CRISPR muy de cerca, cree que los científicos podrían perder el interés en los editores de bases momentáneamente, pero que los problemas desaparecerán pronto. “El campo de CRISPR está en un ciclo con descubrimientos, obstáculos y soluciones,” dice. “La edición de bases nitrogenadas no es una excepción.”

Traducido al español por Fernando Gomollón Bel para C&EN. La versión original (en inglés) de este artículo está disponible aquí.