Las personas con enfermedades pulmonares crónicas, como la fibrosis quística, se ven atrapadas en un círculo vicioso: las infecciones causan inflamación y las células inmunitarias se precipitan hacia las vías respiratorias, pero en el proceso de matar bacterias infecciosas, algunas enzimas permanecen unidas a la superficie de las células inmunitarias que las secretaron, causando más daño en los tejidos e inflamación. Un nuevo método permite a los investigadores rastrear la actividad de esta enzima inflamatoria en las células de los pacientes. El método, que se basa en una combinación de enfoques basados en la fluorescencia, podría ayudar a monitorizar cómo responden los pacientes a la terapia (ACS Cent. Sci. 2019, DOI: 10.1021/acscentsci.8b00933).
Carsten Schultz, de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregon (Portland, EEUU), y sus colegas desarrollaron la técnica para medir la actividad de la catepsina G, una de las varias proteasas secretadas por las células inmunitarias conocidas como neutrófilos. Aunque estudios previos han examinado otras enzimas, Schultz quería ver si la catepsina G era una de las enzimas aún adherida a la superficie celular y, por lo tanto, podría ser un marcador de inflamación. Estudios previos analizaron muestras clínicas utilizando citometría de flujo, una técnica de clasificación celular, para evaluar la presencia de proteasas relacionadas, o microscopía confocal para medir la actividad de las enzimas. Pero la citometría de flujo por sí sola no revela si una proteína de superficie está activa—y causa inflamación—y la microscopía requiere varias horas para procesar una sola muestra, por lo que no es factible para usos clínicos de rutina.
En el nuevo estudio, el equipo realizó un seguimiento de la catepsina G con un método para detectar las interacciones peptídicas, la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET, por sus siglas en inglés), en la que una sonda fluorescente transfiere energía a otra cuando las dos están lo suficientemente cerca para hacerlo, provocando un brillo a una longitud de onda determinada. El equipo eligió un péptido que la catepsina G escindiría, añadió un marcador de lípidos para que se enfocase en la membrana celular, y lo fijó a dos moléculas sensibles a la luz situadas muy próximas entre sí. Cuando la catepsina G ya unida a la membrana estaba activa y digirió el péptido, las dos partes fluorescentes se separaron, cambiando la señal emitida.
Para hacer uso de la técnica, los investigadores utilizaron en primer lugar la citometría de flujo para aislar los neutrófilos secretores de catepsina G de otras células en muestras de esputo de personas con y sin fibrosis quística. Luego llevaron a cabo las pruebas de FRET en los neutrófilos y encontraron que las células de las personas con fibrosis quística mostraban aproximadamente tres veces más actividad de catepsina G que las células de control.
En condiciones como la fibrosis quística donde ya existe una inflamación, este ensayo “podría ayudar a monitorizar la respuesta a un medicamento,” dice Schultz, mientras que en otras afecciones pulmonares, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la prueba “podría ayudar a detectar señales inflamatorias tempranas” para detectar la enfermedad pronto y poderla monitorizar.
Combinar la citometría de flujo con un ensayo de actividad enzimática basado en la fluorescencia es un enfoque viable para el uso clínico, dice Matteo Guerra, estudiante de doctorado en la Universidad de Heidelberg (Alemania) y coautor del estudio. Como el método evalúa marcadores inflamatorios comunes, puede adaptarse a otras afecciones como la artritis, añade.
Los resultados con muestras clínicas son comparables a otros métodos existentes como la microscopía confocal, dice Matthew Bogyo, de la Universidad de Stanford (California, EEUU), quien estudia la actividad enzimática en sistemas biológicos y no participó en el estudio. La fortaleza del estudio reside en que podría utilizarse con muestras clínicas, permitiendo un diagnóstico de la inflamación más rápido que la microscopía.
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