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Biotechnology
C&EN 中文版
CRISPR碱基编辑器导致意外突变
一对研究表明，胞嘧啶碱基编辑器，而非腺嘌呤编辑器，导致了编辑的脱靶效应
by Ryan Cross
February 28, 2019
| A version of this story appeared in
Volume 97, Issue 9
Credit: 图片来源：蛋白质数据银行/《化学和工程新闻》
胞嘧啶碱基编辑器图解，其中包含两个部分：胞苷脱氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂 。这两个部分在腺嘌呤碱基编辑器上是没有的，而这些部分可能会产生意外的突变。
来自两个独立小组的论文表明，一种称为碱基编辑的CRISPR基因编辑形式，在小鼠胚胎和水稻中引起了大量不可预测的突变。
这不是CRISPR技术史上的第一盏红灯。其他团体早前也提出了对脱靶突变的担忧，这种脱靶突变是由传统的CRISPR-Cas9形式的基因编辑在一个它不应该接触的位置剪切DNA而造成的。 然而，新研究结果令人感到惊讶，因为科学家先前称赞碱基编辑器是最精确的基因编辑方法之一。
碱基编辑器被设计为在不需要切割DNA的情况下将DNA的一个核苷酸或字母更改为另一个。编辑器有两种形式：胞嘧啶碱基编辑器，将胞嘧啶（C）核苷酸转换为胸腺嘧啶（T），和腺嘌呤碱基编辑器，将腺苷（A）转化为鸟苷（G）。 这两种形式都是在麻省理工学院和哈佛大学博德研究所 (Broad Institute) 的David Liu实验室中创建的。
数十个实验室已经使用植物和动物的碱基编辑发表了论文。David Liu 也作为合作创立人创办了两家初创公司：Pairwise Plants和Beam Therapeutics，用于将该编辑技术商业化 。
发现由CRISPR引起的脱靶突变可能会十分困难。因为来自不同生物的细胞，甚至来自相同生物的不同细胞，会由于随时间自发产生的自然突变而具有略微不同的DNA。 除非编辑细胞和未编辑细胞之间的DNA最初完全相同，否则很难知道差异是由CRISPR还是天然突变引起的。
Hui Yang（杨辉）和上海生命科学研究院的一组研究人员设计了一种巧妙的技术来分辩这两种突变。 实验使用只有两个细胞的小鼠胚胎，而两胚胎应具有相同的DNA 。研究人员将CRISPR-Cas9或胞嘧啶 (Cytidine) 碱基编辑器注射到一个细胞中，而另一个细胞未编辑。 在胚胎生长两周后，他们对两胚胎的DNA进行测序以比较编辑过的和未编辑的细胞。 相对于CRISPR-Cas9编辑过的以及未经过任何编辑的细胞，胞嘧啶碱基编辑器编辑过的细胞有二十倍的单字母DNA突变。 杨说：“这一结果让所有人感到惊讶“。
Credit: 图片来源：由《自然》改编
在胞嘧啶碱基编辑器中，向导RNA有助于胞苷脱氨酶将特定的C转换为DNA中的U。 在DNA修复和复制期间，细胞将G：U错配改变为A：T碱基对。
杨招募了斯坦福大学遗传学家Lars Steinmetz来帮助分析数据。 杨说：“我曾预计碱基编辑可能比CRISPR-Cas9剪切更安全。“ 此后又出现了另一个费解的事情： 杨的团队用腺嘌呤（Adenine）碱基编辑器重复了这项实验，却没有发现同样的问题（Science 2019, DOI: 10.1126/science.aav9973）。
“我认为这些结果引起了对胞嘧啶碱基编辑领域的高度关注，”杨说。 “研究人员需要制造具有更高特异性的碱基编辑器来解决这个问题。”他的实验室已经在研究具有更少脱靶效应的碱基编辑器。
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另一项由北京遗传与发育生物学研究所的植物遗传学家Caixia Gao（高彩霞）领导的独立研究发现，在水稻中测试胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器时得到了类似的结果。 她的团队还发现，即使缺乏编辑器的关键部分 --向导RNA，胞嘧啶碱基编辑器仍然会产生突变（Science 2019, DOI: 10.1126/science.aaw7166）。
CRISPR-Cas9和碱基编辑器都通过向导RNA而被导入其靶向编辑位点。 选择不当的向导（RNA）可以导致在DNA位点产生突变。这些突变位点的序列与导向序列可以紧致但不完美地互补。 科学家已经通过优化向导RNA设计改进了各种CRISPR编辑。
Steinmetz认为，有可能可以解释为什么胞嘧啶碱基编辑器即使在其导向RNA被“扣留”时，也会产生突变。 胞苷碱编辑器含有一种被称为胞苷脱氨酶的酶，可将胞嘧啶核苷（C）酸转化为尿嘧啶（U）。 在DNA复制或修复过程中，不属于DNA的尿嘧啶被胸腺嘧啶取代，由此产生预期的碱基编辑。 Steinmetz建议，胞苷脱氨酶可以单独作用于DNA，而不遵循碱基编辑的导向。 这对使用不同酶进行编辑的腺嘌呤碱基编辑器来说不是问题。
“碱基编辑还处于起步阶段，所以我们还会发现类似的问题，因为这个领域还太新，”Alexis Komor说道，她在David Liu的实验室做博士后时设计了原始的胞嘧啶碱基编辑器。 Komor现在在加利福尼亚大学圣地亚哥分校运行自己的实验室，她认为这个问题的可能解决方案，是通过设计胞苷脱氨酶使其不能单独结合DNA。
另一个潜在的问题是尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI）。 Komor将这种抑制剂添加到胞嘧啶碱基编辑器中，以防止细胞将尿嘧啶变回胞嘧啶。 尿嘧啶实际上是DNA中自发产生的常见突变，因此细胞具有快速修复这些突变的机制。 Komor认为，胞嘧啶碱基编辑器上的UGI可能会阻止细胞的正常修复过程。
这些论文已经让CRISPR科学家们呼吁推动更好的碱基编辑。 宾夕法尼亚州立大学的Yinong Yang是一位使用CRISPR设计非褐变蘑菇的植物病理学家，他说：“与胞嘧啶碱基编辑器相关的高脱靶率对我们来说是令人惊讶和警醒的。” Yang说，（这两项）新研究表明，胞嘧啶碱基编辑器的特异性“需要显著改善”。
几个小组已经发布了描述新版碱基编辑器的报告，其中包括威尔康奈尔医学院的癌症生物学家Lukas Dow。 他说，他的实验室已经提高了编辑器的预期编辑效率，但还没有做太多工作来减少脱靶编辑。 他对新实验的技术技巧表示赞赏，但他补充道，“关于如何解读这些论文，还有很多未知的东西。”
例如，目前尚不清楚小鼠胚胎编辑结果是否与成人细胞中使用碱基编辑器时的结果相似。 Liu指出，新实验中使用的剂量远远高于人类治疗中可能使用的剂量。 他还提出，来自胞嘧啶碱基编辑器的突变率可能不像它们看起来那么高 – 与人类细胞中天然观察到的突变率大致相同。 他说，引入这些突变的风险必须与所治疗疾病的严重程度进行权衡。
Beam Therapeutics是一家初创公司，其去年筹集了8700万美元用于创造治疗人类疾病的碱基编辑器。该公司认为这些文章中提出的问题是可以克服的。 “我们非常有信心这些将研究成果会成为药品，我们将把它们推向临床，”Beam首席执行官John Evans说。 “这意味着，我们仍有工作要做。”
Evans说，Beam已经有10个活跃的药物发现项目，使用胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器来治疗遗传性疾病。 他说：“我们并不认为这一脱靶现象的发现是将这些碱基编辑器推向患者的一个特殊障碍。所以我们仍然在向前推进我们的研发。”
CRISPR领域一直有一些共同的担忧，例如临床前研究表明CRISPR可能导致癌症或免疫反应。 其中一些最初的担忧被夸大了，而其它观点的重要性在临床研究数据出现之前不会变得明晰。来自澳大利亚国立大学的科学家Gaétan Burgio一直密切关注CRISPR的发展。他认为，科学家可能对碱基编辑器暂时失去兴趣，但随后这种担忧可能会慢慢消散。“CRISPR领域具有发现 –阻碍 – 解决这一循环规律”，他说， “碱基编辑也不例外。”.
该报道由李杰为C&EN翻译。文章的原始英文版本如下。
Chemical & Engineering News
ISSN 0009-2347
Copyright © 2025 American Chemical Society
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