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Gene Editing

C&EN 中文版

David Liu推出一种能搜索及替换的CRISPR工具以及一家初创公司将其商业化

Beam Therapeutics和一家名为Prime Medicine的初创公司将开发基于先导编辑器（prime editor）的治疗手段 。该编辑方法可以在基因组中的任何位置进行添加、删除或修改核苷酸。

by Ryan Cross
October 28, 2019 | A version of this story appeared in Volume 97, Issue 42
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A model of the prime editing system, showing Cas9, the reverse transcriptase, the guide RNA, and DNA.
Credit: Peyton Randolph
在先导编辑器的这个模型中，修饰过的Cas9酶（蓝色）与逆转录酶（红色）形成复合物，在向导RNA（绿色）的引导下，该复合物可以添加、改变、或者移除在特定DNA区域的核苷酸（黄色与紫色的螺旋结构）。

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基于麻省理工-哈佛大学Broad研究所David Liu(刘如谦)实验室发明的一种新的CRISPER基因编辑系统，科学家们离随心所欲编辑DNA的时代更进一步。 这些工具被称为先导编辑器（prime editors），它们可能是生物学家一直在期待的、能够搜索和替换（碱基）的基因编辑器。

不同于普遍的看法，CRISPR-Cas9基因编辑并不是万能的。经典的CRISPR工具非常适合剪切DNA，而且生物技术公司已经将该技术运用到实验治疗中，来引入突变达到沉默或者激活基因的目的。 CRISPR碱基编辑器由刘如谦实验室于2016年研发，它可以将特定的DNA碱基转换为其它碱基。 如今，刘如谦和他实验室的博士后 Andrew Anzalone首次推出了先导编辑器，其可以针对任何DNA碱基并将其转换为任何其它碱基，以及插入新的DNA片段或去除不需要的片段。

“如果把CRISPR-Cas9和其他可程序化控制的核酸酶比作剪刀、把碱基编辑器比作铅笔、那么您可以把先导编辑器当作成文字处理器，”刘如谦在与记者的电话中说。

刘如谦的团队在实验室中利用他们研发的先导编辑器对人体细胞进行了超过175次编辑。他估计先导编辑器可修复75,000个导致人类疾病的遗传突变中的89%（Nature 2019, DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4）。

尽管先导编辑器尚未用动物进行过测试，并且该技术与以前的CRISPR系统一样具有局限性，但其仍然吸引了投资者。 刘如谦与其他人共同成立了一家名为Prime Medicine的公司，此举增强了他作为连续企业家(serial entrepreneur)的地位，并反映了投资者对新型基因编辑工具的渴望。

刘如谦之前曾与他人共同创立了两家公司：Pairwise Plants和Beam Therapeutics。这两家公司将他的碱基编辑工具应用于农业和人类医疗。 Beam于2018年5月以8700万美元初始资金进行启动，最近在纳斯达克进行了1亿美元的首次公开募股。 他坚持认为CRISPR-Cas9，碱基编辑器和prime editor将会在临床上有用武之地。

Memorial Sloan Kettering癌症中心的基因编辑先驱、DNA修复专家Maria Jasin表示，先导编辑未来可能会取代其它基因编辑系统。 “虽然很难通过一篇论文来下定论，但是先导编辑肯定会引起效仿者们极大的兴趣。”

现有的CRISPR系统具有明显的局限性。 CRISPR-Cas9可以切割DNA的双链，当细胞试图修复这种断裂时，有时会通过添加或去除DNA或核苷酸的单个碱基来引入突变。 这对于关闭问题基因或通过破坏沉默基因的关闭开关从而激活沉默基因非常有用。 许多小组曾尝试将新的DNA插入断开的双链中，但结果并不一致。

胞苷碱基编辑器可以将C转换为T，G转换为A。腺嘌呤碱基编辑器可以将A转换为G，T转换为C。但是还有8种其它类型的核苷酸变化：如T转换为A和A转换为T，是这两种碱基编辑器无法完成的操作。 这种局限性激发了Anzalone（于2018年加入刘如谦的实验室）设计出一个可以进行12种可能的核苷酸间转化的系统。

受经典CRISPR系统的启发，Anzalone创建了一个 小的分子机器，该分子机器使用Cas9切割DNA，使用一种称为向导RNA的分子来告诉Cas9具体的切割位置。 Anzalone的先导编辑器使用专门的向导RNA来指导一种改良过的Cas9进行剪切；这种修剪仅切割DNA双螺旋的其中一条链。这会导致DNA链的一部分从螺旋中脱出。 从DNA中脱出的部分可以被用作DNA引物，这一原理也是先导编辑器名字的由来。 接下来，逆转录酶抓取该引物，并由它开始，以向导RNA序列为模板，将新的DNA序列写入切割位点。 最后，细胞的修复机制将新DNA完全整合到双螺旋的两条链中。

该团队在人类和小鼠细胞中测试了其编辑器的多次迭代使用。 在一个实验中，他们使用该技术修复了导致镰状细胞贫血的单核苷酸突变。 在其它实验中，他们使用先导编辑器删除了4个引起Tay-Sachs病的外来核苷酸，并添加了3个引起囊性纤维化的突变中缺失的核苷酸。 总体而言，刘如谦的实验室表明，prime editor可以实现所有12种单核苷酸转换，插入最长为44个核苷酸的新DNA序列，或删除长达80个碱基对的序列。

刘如谦已将他的先导编辑器放入非营利性基因库Addgene中，并允许将其用于非商业目的。

刘如谦的新公司Prime Medicine已将先导编辑器授权给其自己的碱基编辑公司Beam Therapeutics进行某些特定应用。 Beam的网站显示该公司正在开发用于修复常见的、只能由先导编辑器来修正的镰状细胞疾病突变的疗法。

加州大学伯克利分校的CRISPR科学家Ross Wilson预测，与碱基编辑器相比，“先导编辑器的使用可能更直接、更广泛”。 不过，先导编辑器自身也有局限性。 他指出：“先导编辑器可能会因为其较大的体积在给药方面面对严峻的挑战，” 刘如谦的实验室使用电击（electrical zap）将先导编辑器所需的DNA片段转入培养皿中的细胞。 但是，这种方法无法使先导编辑器进入动物或人体，运输先导编辑器的“快递工作”可能需要将它们包装在纳米颗粒或病毒中。 使用经典的CRISPR-Cas9很难做到这一点，更不用说体积更大的、包括结合于Cas9的逆转录酶以及向导RNA的先导编辑器了。

刘如谦承认，目前，他的先导编辑器还不如现有的碱基编辑器高效，而且先导编辑器仍然会犯错误; 如果在人类中使用的话，可能有需要改进的地方。 并且，有11%的（致病）突变先导编辑器可能无法解决，例如基因中出现的多余或缺失的基因副本。这些突变可能对先导编辑器来说太大，从而无法进行删除或添加。

维多利亚大学的 Francis Choy实验室的研究生Chloe Christensen说：“先导编辑不会取代碱基编辑器或其他CRISPR-Cas9工具，” Christensen正在研发用于治疗溶酶体储存相关疾病的碱基编辑器。 尽管如此，Christensen 说，” 先导编辑器消除了现有碱基编辑的‘严苛参数’”。 “如果说Cas9是剪刀，而碱基编辑是镊子，那么先导编辑器就是瑞士军刀，是最终的多功能工具。”.

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