Novo método intercepta enzima inflamatória da fibrose cística no ato

Pessoas com doenças pulmonares crônicas, como a fibrose cística, são tomadas em um círculo vicioso: As infeções causam inflamação e as células do sistema imunológico entram nas vias aéreas, mas no processo de matar as bactérias infeciosas, algumas enzimas permanecem ligadas à superfície das células imunológicas que as segregam, causando mais danos e inflamação nos tecidos. Um novo método permite aos pesquisadores rastrear essa atividade enzimática inflamatória nas células dos pacientes. O método, que se baseia em uma combinação de abordagens baseadas em fluorescência, poderia ajudar a monitorar como os pacientes respondem à terapia (ACS Cent. Sci. 2019, DOI: 10.1021/acscentsci.8b00933).

Carsten Schultz, da Oregon Health and Science University, e seus colegas desenvolveram a técnica para medir a atividade da catepsina G, uma das várias proteases segregadas por células imunes conhecidas como neutrófilos. Embora estudos anteriores tenham examinado outras enzimas, Schultz queria ver se a catepsina G era uma das enzimas ainda presas na superfície da célula e, portanto, um marcador de inflamação. Estudos anteriores analisaram amostras clínicas usando citometria de fluxo, uma técnica de triagem celular, para testar a presença de proteases relacionadas, ou microscopia confocal para medir a atividade das enzimas. Mas a citometria de fluxo por si só não revela se uma proteína de superfície está ativa - e causando inflamação - e a microscopia requer várias horas para processar uma única amostra, tornando-a inviável para usos clínicos de rotina.

No novo estudo, a equipe rastreou a catepsina G com um método para detectar interações peptídicas, a transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), na qual uma sonda fluorescente transfere energia para outra quando as duas estão próximas o suficiente para fazê-lo em um determinado comprimento de onda. A equipe escolheu um peptídeo que a catepsina G dividiria, acrescentou um marcador lipídico para atingir a membrana celular e acrescentou duas moléculas sensíveis à luz, situadas juntas. Quando a catepsina G ligada à membrana estava ativa e digeriu o peptídeo, as duas partes fluorescentes se dividiram, alterando o sinal emitido.

Para fazer uso da técnica, os pesquisadores primeiro usaram citometria de fluxo para isolar os neutrófilos que segregam catepsina G de outras células em amostras de expetoração de pessoas com e sem fibrose cística. Realizaram então os testes de FRET nos neutrófilos e descobriram que as células de pessoas com fibrose cística mostraram aproximadamente três vezes mais atividade de catepsina G do que as células de controle.

Em condições como a fibrose cística onde a inflamação já existe, tal ensaio “poderia ajudar a monitorar a resposta a uma droga”, diz Schultz, enquanto em outras condições pulmonares, como doença pulmonar obstrutiva crônica, o teste “poderia ajudar a captar sinais inflamatórios precoces” para apanhar a condição precocemente e rastrear a doença.

Combinar a citometria de fluxo com um ensaio baseado em fluorescência da atividade enzimática é uma abordagem viável para uso clínico, diz Matteo Guerra, estudante de pós-graduação da Universidade de Heidelberg e co-autor do estudo. Como o método avalia marcadores inflamatórios comuns, ele pode ser adaptado a outras condições, como artrite, diz Matteo Guerra.

Os resultados com amostras clínicas são comparáveis a outros métodos existentes, como a microscopia confocal, diz Matthew Bogyo, da Stanford University, que estuda a atividade enzimática em sistemas biológicos e não participou do estudo. A força do estudo é que ele poderia ser usado com amostras clínicas, permitindo um diagnóstico mais rápido da inflamação do que a microscopia.